Caros leitores, um dos principais testes utilizados no imunodiagnóstico de HIV ( Human Immunodeficiency Vírus), vírus causador da AIDS (Síndrome da Deficiência Imunológica Adiquirida) é o teste ELISA.
Na aula prática de Virologia que foi ministrada no dia 20 de maio de 2014 no laboratório da Faculdade Icesp Promove de Brasília pelo ilustre Professor Mestre Leandro, foram ressaltados aspectos essenciais sobre imunologia e virologia clínica.
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| Raquel Alves, T. Tuany, Zonaite Gomes, Rafael Brnadão e Iolanda Bianca |
Entendeu-se que o teste de ELISA (“Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay) se baseia reações antígeno-anticorpo detectáveis através de reações enzimáticas. A enzima mais comumente utilizada nestas provas é a peroxidase, que catalisa a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2) em H2O mais O2.
Segundo Duarte 1998, existem vários modelos de testes de ELISA; em sua forma mais simples, chamada ELISA indireto, um antígeno aderido a um suporte sólido (placa de ELISA) é preparado; a seguir coloca-se sobre este os soros em teste ( ex. soro humano), na busca de anticorpos contra o antígeno. Se houver anticorpos no soro em teste ocorrerá a formação da ligação antígeno-anticorpo, que posteriormente é detectada pela adição de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie onde se busca detectar os anticorpos (humana, no caso), a qual é ligada à peroxidase. Este anticorpo anti-IgG, ligado à enzima denomina-se conjugado.
Ao adicionar-se o substrato apropriado para a enzima (isto é, H2O2 dissolvida em uma substancia química que dá uma reação colorida quando H2O2 é desdobrada). Os orifícios onde ocorreu a reação antígeno-anticorpo apresentam uma coloração (variável dependendo do substrato). (Duarte 1998)
Outro método é o chamado ELISA de bloqueio ou competição, em que a presença de anticorpos em determinado soro é revelada pela competição com um anticorpo específico (mono ou policlonal) dirigido contra o antígeno. Igualmente, o resultado é dado pela adição de um conjugado, porém a coloração aparecerá nos orifícios onde não havia anticorpos. A seguir, temos um modelo de teste de ELISA de bloqueio, desenvolvido por nós e utilizado amplamente em nosso laboratório para o diagnóstico de anticorpos contra herpesvírus bovinos. (Castilho; Bastos; Scwarcwald; Fonseca, 2000)
Método:
1 – Sensibilizar as placas de ELISA com o antígeno, previamente diluído (no nosso exemplo, diluído a 1/200, correspondente à diluição considerada ótima em titulações anteriores), em tampão carbonato (vide fórmulas no final), 100 ul por orifício, e incubar overnight a 4 oC. Isto permitirá a ligação do
antígeno à placa.
2- No dia seguinte, remover a solução de antígeno e lavar a placa 3 vezes com líquido de lavagem de ELISA (PBS-T20), em volume de 100 ul por orifício.
3- A placa pode então ser armazenada para uso posterior (em sacos plásticos fechados a – 20 oC, ou utilizada imediatamente.
4- Acrescentar os soros a testar em uma diluição previamente determinada ( 1⁄2 em nosso exemplo), preparada em líquido de lavagem, em volumes de 100 ul/orifício. Incubar por uma hora a 37 oC.5- Remover a diluição dos soros e lavar três vezes com líquido de lavagem.
6- Acrescentar 100 ml por orifício de uma diluição apropriada do anticorpo monoclonal (1:1000 em nosso exemplo), preparada em líquido de lavagem. Incubar por uma hora a 37 oC.
7 - Remover o anticorpo monoclonal e lavar três vezes com líquido de lavagem.
8- Acrescentar 100 ml por orifício de uma diluição apropriada do conjugado (anti- IgG de camundongos; 1:1000 em nosso exemplo), preparada em líquido de lavagem. Incubar por uma hora a 37 oC.
9- Remover a diluição de conjugado e lavar três vezes com líquido de lavagem.
10- Acrescentar 100 ml por orifício de uma solução de OPD (ortofenilenodiamina) preparada em tampão citrato-fosfato acrescentado de 0,001% de H2O2. Incubar por 15 minutos a 37 oC.
11- A reação é interrompida pela adição de 50 ml por orifício de uma solução de H2SO4 2M.
12- Os resultados são obtidos com base na leitura da densidade ótica
(D.O.) em espectrofotômetro com filtro de 492 nm. (podendo este filtro variar de acordo com o estipulado na bula do kit do teste) (Marques; Latorre; Della; Pluciennik; Salomão, 2002)
Referências Bibliográficas:
Duarte G. Síndrome da imunodeficiência adquirida tipo-1 e gravidez. In: Cunha SP, Duarte G, editores. Gestação de Alto Risco. 1a ed. São Paulo: Medsi; 1998. p.227-46.
Castilho EA, Bastos FI, Scwarcwald CL, Fonseca MGM. A AIDS no Brasil: uma epidemia em mutação. Cad Saúde Publica 2000; 16 (Suppl 1):4-5
Marques HHS, Latorre MRDO, Della Negra M, Pluciennik AMA, Salomão MLM. Falhas na
identificação da infecção pelo HIV durante a gravidez em São Paulo. Rev Saúde Pública 2002; 36:385-92.
Espero ter ajudado!!
Atenciosamente, Rafaell Silva Brandão
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